Franco Grimaldi & Elda Kara
SOC Endocrinologia, Malattie del Metabolismo e Nutrizione Clinica, ASU Friuli Centrale, PO S. Maria della Misericordia, Udine

(aggiornato al 3 luglio 2020)

La classificazione OMS 2019 delle neoplasie neuroendocrine (NEN) gastro-entero-pancreatiche (GEP) si basa su sede, grado di differenziazione, grado di malignità, stadio di malattia e caratterizzazione in base all’eventuale produzione ormonale (1-6) (tabella).
Le classificazioni WHO sono specificamente intese per neoplasie asportate chirurgicamente (7,8) e la loro applicazione in campioni citologici o istologici bioptici è possibile con maggiore riproducibilità e sensibilità nei NEC (9). Nelle NEN è opportuno specificare nel referto anatomo-patologico il limite intrinseco al tipo di materiale per la definizione del valore percentuale di Ki67, dell’indice mitotico e conseguentemente del grading della neoplasia (10,11).

Grading
L’ultima classificazione OMS 2019 distingue le GEP NEN in base agli aspetti morfologici, istopatologici e dell’attività cito-proliferativa del tumore, espressa come grading (G). Il grading si basa sull’indice proliferativo del tumore (numero di mitosi su 10 campi ad alto ingrandimento - HPF, High Power Field, con ingrandimento minimo 40X) o come valore di Ki67 (parametro immmuno-istochimico che si ottiene misurando la percentuale di cellule positive all’anticorpo MIB-1 su 500-2.000 cellule, valutato nell’area di maggiore marcatura nucleare). In base alla valutazione della conta mitotica e dell’indice di proliferazione con Ki67 viene definito il grading della NEN: NET G1, NET G2, NET G3 e NEC.
Il cut-off proposto per distinguere NET G1 rispetto a NET G2 è di 2 mitosi /10 HPF e 3% di indice Ki67. Una conta mitotica > 20/10 HPF e un indice Ki67 > 20% definiscono i NEC (7,8).
I suddetti principi, proposti inizialmente nella classificazione OMS 2010, sono stati parzialmente modificati nella classificazione del 2017 che riguardava solo la sede pancreatica (9). Il risultato delle modifiche apportate alla classificazione OMS 2010 nella versione 2017 per la sola sede pancreatica è stato condensato, recepito ed esteso a tutto l’apparato GEP nella classificazione OMS 2019 (6).

Riassunto delle principali modifiche tra la classificazione OMS 2019 e la precedente del 2010

• Valore di cut-off di Ki67 tra NET G1 e G2: dal 2% al 3%.
• Categoria NET G3: caratterizzata da neoplasie ben differenziate ma ad indice proliferativo Ki67 > 20%. La categoria dei NET G3 include NEN caratterizzate da elevata attività proliferativa, ma morfologia ben differenziata, tipica delle NEN. La necessità di riconoscere questo nuovo sottogruppo è nata dall’osservazione di un andamento clinico più favorevole e una differente risposta alle terapie mediche di questo sottogruppo di pazienti rispetto a quella di pazienti con neoplasia scarsamente differenziata. Lo studio di Milione et al (12) ha dimostrato che una morfologia ben differenziata costituisce un fattore prognostico indipendente per le GEP NEN con Ki67 compreso fra 20 e 55% (NET G3 e NEC con Ki67 20-55%), mentre il cut-off di Ki67 del 55% è un fattore prognostico indipendente per le GEP NEN scarsamente differenziate. Il Ki67 della componente neuroendocrina sembra essere il fattore prognostico principale anche per i MANEC (13).
• Neoplasie miste MiNEN (mixed neuroendocrine-non neuroendocrine neoplasm). Vengono considerate tali le neoplasie nelle quali le due componenti, neuroendocrina e non-neuroendocrina, siano rappresentate entrambe in almeno il 30% delle cellule tumorali (14). Il termine MiNEN nasce dalla necessità di considerare la rara eventualità in cui la componente neuroendocrina sia di tipo ben differenziato. È tuttavia consigliabile, nei casi di gran lunga più frequenti in cui la neoplasia mista si presenti con NEC, associare al nuovo termine il precedente MANEC, in considerazione del rilevante valore predittivo sull’outcome clinico esercitato dalla componente NEC; a questo proposito sarebbe opportuno esplicitare anche il valore di Ki-67 della componente NEC, risultato il più potente predittore indipendente di sopravvivenza nei pazienti affetti da MANEC (13).

Morfologia

Le GEP NEN si distinguono in “tumori” e “carcinomi” (tabella).
I NET vengono distinti in due categorie prognostiche:

• NET (G1, G2 e G3) in base alla conta mitotica e/o alla valutazione quantitativa dell’espressione immuno-istochimica del Ki67;
• NEC, che presentano crescita diffusa, solida, con estesa necrosi e numerose atipie citologiche e sono distinti in due sottogruppi morfologici, a piccole e a grandi cellule (15-19).

Le definizioni derivanti dalla classificazione OMS 2019 devono essere necessariamente integrate e completate dalla definizione dello stadio TNM (estensione dell’invasione neoplastica) (6,7,20-23).
Ulteriori parametri non sono obbligatori per tutti i referti, ma possono risultare utili in specifici casi di GEP-NEN: dimensioni del tumore, multi-centricità, presenza di invasione vascolare e/o peri-neurale, stato dei margini di resezione chirurgica, distanza del tumore dai margini stessi. Ad esempio, nelle NEN appendicolari è necessario avere la dimensione macroscopica del tumore, lo stato dei margini e dell’infiltrazione del meso; nello stomaco è consigliata la valutazione quantitativa e qualitativa delle lesioni iperplastiche e/o displastiche delle cellule enterochromaffin-like (ECL) nel contesto di gastrite cronica atrofica del corpo gastrico (24,25).

Profilo immuno-istochimico
L’identificazione del fenotipo neuroendocrino prevede l’utilizzo di marcatori immuno-istochimici capaci di definire la natura neuroendocrina della neoplasia: Cromogranina A (CgA) e Sinaptofisina (SIN). I restanti marcatori neuroendocrini generali CD56 (N-CAM), PGP 9.5, NSE (enolasi neurono-specifica) sono poco affidabili e riproducibili: nelle condizioni in cui la natura neuroendocrina della neoplasia è sostenuta solo da uno di questi, in assenza di convincente positività almeno per SIN è opportuno discutere il caso nell’ambito di un tavolo multi-disciplinare.
I NEC preservano la positività per SIN ma possono mostrare espressione ridotta di CgA. Per le NEN scarsamente differenziate è opportuno in casi dubbi ricorrere anche a tecniche FISH e PCR per la definizione del corretto fenotipo tumorale (26). Ancorché la secrezione ormonale non sia sinonimo di sindrome ormono-correlata e non rappresenti pertanto prova di funzionalità della NEN, la definizione del profilo di produzione ormonale (insulina, glucagone, somatostatina, polipeptide intestinale vasoattivo, gastrina, serotonina, calcitonina) è un utile complemento alla diagnosi (soprattutto per NEN pancreatiche e duodenali).
Per definire l’origine di una NEN a primitività occulta possono essere utili fattori trascrizionali, quali TTF-1 (che depone per origine polmonare) (27), CDX-2 (origine GEP, con espressione più intensa ed estesa per le sedi intestinali) (28), Islet-1 (origine pancreatica) (29). Le informazioni ottenute dall’uso di questi marcatori vanno comunque interpretate in un contesto clinico appropriato, in considerazione del fatto che l’affidabilità dell’espressione di questi fattori di trascrizione è inversamente proporzionale al grado di differenziazione della NEN.
La ricerca immuno-istochimica dei recettori per la somatostatina (SSTR) è considerata opzionale, ristretta al sottotipo 2 ed eventualmente al 3 e 5, che sono i recettori bersaglio di octreotide e lanreotide, con l’uso di anticorpi monoclonali: viene interpretata come positiva in presenza di una reattività di membrana, per la cui valutazione è consigliabile l’uso di punteggi, secondo proposte pubblicate e validate (30).

Conclusioni
I requisiti minimi indispensabili in un esame istologico possono essere riassunti come segue:

• morfologia tumorale (tumore ben differenziato o scarsamente differenziato);
• immuno-istochimica positiva per CgA e SIN;
• proliferazione tumorale valutata con Ki-67 e indice mitotico.

In caso di materiale operatorio, è necessario integrare il referto anatomo-patologico con la valutazione di:

• angio-invasione;
• invasione peri-neurale;
• invasione locale: profondità d’invasione per i visceri e infiltrazione del parenchima esocrino nel pancreas;
• stadio secondo TNM.

Bibliografia

1. Bosman FT. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics. Tumors of the Digestive System. 4^th Edition. International Agency for Research on Cancer, Lyon (France): 2010.
2. Boudreaux JP, Klimstra DS, Hassan MM, et al. The NANETS consensus guideline for the diagnosis and management of neuroendocrine tumors: well-differentiated neuroendocrine tumors of the jejunum, ileum, appendix, and cecum. Pancreas 2010, 39: 753-66.
3. Panzuto F, Boninsegna L, Fazio N, et al. Metastatic and locally advanced pancreatic endocrine carcinomas: analysis of factors associated with disease progression. J Clin Oncol 2011, 29: 2372–7.
4. Vinik AI, Woltering EA, Warner RR, et al. NANETS consensus guidelines for the diagnosis of neuroendocrine tumor. Pancreas 2010, 39: 713-34.
5. La Rosa S, Sessa F, Uccella S. Mixed Neuroendocrine-Nonneuroendocrine Neoplasms (MiNENs): unifying the concept of a heterogeneous group of neoplasms. Endocr Pathol 2016, 27: 284-311.
6. WHO Classification of Tumours Editorial Board. Digestive system tumours. 5th Edition. International Agency for Research on Cancer, Lyon (France), 2019.
7. Rindi G, Kloppel G, Alhman H, et al. TNM staging of foregut (neuro)endocrine tumors: a consensus proposal including a grading system. Virchows Arch 2006, 449: 395-401.
8. Carlinfante G, Baccarini P, Berretti D, et al. Ki-67 cytological index can distinguish well-differentiated from poorly differentiated pancreatic neuroendocrine tumors: a comparative cytohistological study of 53 cases. Virchows Arch 2014, 465: 49-55.
9. Neoplasms of the neuroendocrine pancreas. In: Lloyd RV, Osamura RY, Klöppel G, Rosai J (Eds). WHO Classification of Tumours of Endocrine Organs. WHO/IARC Classification of Tumours, 4th Edition, 2017, volume 10: page 209–39.
10. Grillo F, Albertelli M, Brisigotti MP, et al. Grade increases in gastro-entero-pancreatic neuroendocrine tumor metastases compared to the primary tumor. Neuroendocrinology 2016, 103: 452-9.
11. Tatsumoto S KY, Sakurai Y, Shinohara T, et al. Pancreatic neuroendocrine neoplasm: correlation between computed tomography enhancement patterns and prognostic factors of surgical and endoscopic ultrasound-guided fine-needle aspiration biopsy specimens. Abdom Imaging 2013, 38: 358-66.
12. Milione M, Maisonneuve P, Spada F, et al. The clinicopathologic heterogeneity of grade 3 gastroenteropancreatic neoplasms: morphological differentiation and proliferation identify different prognostic categories. Neuroendocrinology 2017, 104: 85-93.
13. Milione M, Maisonneuve P, Pellegrinelli A, et al. Ki67 proliferative index of the neuroendocrine component drives MANEC prognosis. Endocr Relat Cancer 2018, 25: 583-93.
14. La Rosa S, Adsay V, Albarello L, et al. Clinicopathologic study of 62 acinar cell carcinomas of the pancreas: insights into the morphology and immunophenotype and search for prognostic markers. Amer J Surg Pathol 2012, 36: 1782-95.
15. Bettini R, Boninsegna L, Mantovani W, et al. Prognostic factors at diagnosis and value of WHO classification in a mono-institutional series of 180 non-functioning pancreatic endocrine tumours. Ann Oncol 2008, 19: 903-8.
16. Ekeblad S, Skogseid B, Dunder K, et al. Prognostic factors and survival in 324 patients with pancreatic endocrine tumor treated at a single institution. Clin Cancer Res 2008, 14: 7798-803.
17. Franko J, Feng W, Yip L, et al. Non-functional neuroendocrine carcinoma of the pancreas: incidence, tumor biology, and outcomes in 2,158 patients. J Gastrointest Surg 2010, 14: 541-8.
18. Panzuto F, Nasoni S, Falconi M, et al. Prognostic factors and survival in endocrine tumor patients: comparison between gastrointestinal and pancreatic localization. Endocr Relat Cancer 2005, 12: 1083-92.
19. Kloppel G, Rindi G, Perren A, et al. The ENETS and AJCC/UICC TNM classifications of the neuroendocrine tumors of the gastrointestinal tract and the pancreas: a statement. Virchows Archiv 2010, 456: 595-7.
20. Pape UF, Perren A, Niederle B, et al. ENETS Consensus guidelines for the management of patients with neuroendocrine neoplasms from the jejuno-ileum and the appendix including goblet cell carcinomas. Neuroendocrinology 2012, 95: 135-56.
21. Pavel M, Baudin E, Couvelard A, et al. ENETS Consensus Guidelines for the management of patients with liver and other distant metastases from neuroendocrine neoplasms of foregut, midgut, hindgut, and unknown primary. Neuroendocrinology 2012, 95: 157-76.
22. Scarpa A, Mantovani W, Capelli P, et al. Pancreatic endocrine tumors: improved TNM staging and histopathological grading permit a clinically efficient prognostic stratification of patients. Mod Pathol 2010, 23: 824-33.
23. Sobin LH, Gosporadowicz MK, Wittekind K. TNM classification of malignant tumors, 7th edition. Wiley 2011.
24. Peghini PL, Annibale B, Azzoni C, et al. Effect of chronic hypergastrinemia on human enterochromaffin-like cells: insights from patients with sporadic gastrinomas. Gastroenterology 2002, 123: 68-85.
25. Vanoli A, La Rosa S, Luinetti O, et al. Histologic changes in type A chronic atrophic gastritis indicating increased risk of neuroendocrine tumor development: the predictive role of dysplastic and severely hyperplastic enterochromaffin-like cell lesions. Hum Pathol 2013, 44: 1827-37.
26. Milione M, Gasparini P, Sozzi G, et al. Ewing sarcoma of the small bowel: a study of seven cases, including one with the uncommonly reported EWSR1-FEV translocation. Histopathology 2014, 64: 1014-26.
27. Zhang C, Schmidt LA, Hatanaka K, et al. Evaluation of napsin A, TTF-1, p63, p40, and CK5/6 immunohistochemical stains in pulmonary neuroendocrine tumors. Amer J Clin Pathol 2014, 142: 320-4.
28. Zimmermann N, Lazar-Karsten P, Keck T, et al. Expression pattern of CDX2, estrogen and progesterone receptors in primary gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors and metastases. Anticancer Res 2016, 36: 921-4.
29. Schmitt AM, Riniker F, Anlauf M, et al. Islet 1 (Isl1) expression is a reliable marker for pancreatic endocrine tumors and their metastases. Amer J Surg Pathol 2008, 32: 420-5.
30. Volante M, Brizzi MP, Faggiano A, et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol 2007, 20: 1172-82.

Marco Caputo
Dipartimento Servizi di Diagnosi e Cura, AUSL 22 Regione Veneto, Bussolengo (VR)

La cromogranina A (CgA) è un marcatore serico di ampio uso per i NET, ma con alcuni limiti (1).
La CgA circola in differenti forme antigeniche e non è disponibile uno standard di calibrazione universale (2). I risultati ottenuti con metodiche RIA e IRMA sono grosso modo equivalenti (3), ma gli intervalli di riferimento sono variabili e i risultati ottenuti con dosaggi diversi non sono confrontabili.
I livelli di CgA possono aumentare in alcune condizioni patologiche (tabella) e nei soggetti sani dopo il pasto o dopo esercizio fisico. I livelli sono molto variabili nella popolazione generale (4) e possono mostrare un certo grado di sovrapposizione fra I pazienti con NET e I controlli. Di conseguenza il valore della CgA è scarso come prima linea diagnostica (2,4,5-9).

Gli inibitori di pompa protonica (PPI) aumentano I livelli di CgA (fino a 7 volte). L’effetto persiste per parecchi giorni dopo la sospensione dei PPI. Perciò il dosaggio di CgA dovrebbe essere eseguito dopo una sospensione di almeno 2 settimane (4,10). L’effetto degli anti-H2 è ancora controverso (11).

L’accuratezza diagnostica di CgA dipende da alcune variabili:

• estensione del tumore: la sensibilità è stata riportata del 60-100% nei metastatici e del 29-50% nei localizzati (4,7,12);
• tipo e localizzazione del tumore: sensibilità del 96% nei NET funzionanti e del 75% nei non funzionanti (6,13).

Bibliografia

1. Stridsberg M, Öberg K, Li Q, et al. Measurements of chromogranin A, chromogranin B (secretogranin I), chromogranin C (secretogranin II) and pancreastatin in plasma and urine from patients with carcinoid tumours and endocrine pancreatic tumours. J Endocrinol 1995, 144: 49-59.
2. Stridsberg M, Eriksson B, Öberg K, Janson ET. A comparison between three commercial kits for chromogranin A measurements. J Endocrinol 2003, 177: 337-41.
3. Zatelli MC, Torta M, Leon A, et al; Italian CromaNet Working Group. Chromogranin A as a marker of neuroendocrine neoplasia: an Italian Multicenter Study. Endocr Relat Cancer 2007, 14: 473–82.
4. Granberg D, Stridsberg M, Seensalu R, et al. Plasma chromogranin A in patients with multiple endocrine neoplasia type 1. J Clin Endocrinol Metan 1999, 84: 2712-7.
5. Lawrence B, Gustafsson BJ, Kidd M, et al. The clinical relevance of chromogranin A as a biomarker for gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Endocrinol Metab Clin North Am 2011, 40: 111-34.
6. Campana D, Nori F, Piscitelli L, et al. Chromogranin A: is it a useful marker of neuroendocrine tumors? J Clin Oncol 2007, 25: 1967-73.
7. Modlin IM, Gustafsson BI, Moss SF, et al. Chromogranin A--biological function and clinical utility in neuro endocrine tumor disease. Ann Surg Oncol 2010, 17: 2427-43.
8. Singh S, Law C. Chromogranin A: a sensitive biomarker for the detection and post-treatment monitoring of gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol 2012, 6: 313-34.
9. Marotta V, Nuzzo V, Ferrara T, et al. Limitations of Chromogranin A in clinical practice. Biomarkers 2012, 17: 186-91.
10. Mosli HH, Dennis A, Kocha W, et al. Effect of short-term proton pump inhibitor treatment and its discontinuation on chromogranin A in healthy subjects. J Clin Endocrinol Metab 2012, 97: E1731-5.
11. Korse CM, Muller M, Taal BG. Discontinuation of proton pump inhibitors during assessment of chromogranin A levels in patients with neuroendocrine tumours. Br J Cancer 2011, 105: 1173-5.
12. Nikou GC, Marinou K, Thomakos P, et al. Chromogranin A levels in diagnosis, treatment and follow-up of 42 patients with non-functioning pancreatic endocrine tumours. Pancreatology 2008, 8: 510-9.
13. Panzuto F, Severi C, Cannizzaro R, et al. Utility of combined use of plasma levels of chromogranin A and pancreatic polypeptide in the diagnosis of gastrointestinal and pancreatic endocrine tumors. J Endocrinol Invest 2004, 27: 6-11.

La determinazione dei marcatori serici non deve essere usata come prima linea per la diagnosi di NET, mentre il suo uso è appropriato per monitorare la risposta al trattamento e per il follow-up.
In fase diagnostica i marcatori devono quindi essere usati solo dopo:

• aver fatto la diagnosi di NET o in presenza di sospetto clinico molto forte
• avere escluso le possibili condizioni fisiologiche e patologiche di confondimento.

Cromogranina

Altri marcatori generali

Marcatori specifici

Test dinamici

Valutazione genetica

NETest (biopsia liquida multigenica dei tumori neuroendocrini)

Bibliografia

1. Ardill JE, Eriksson B. The importance of the measurement of circulating markers in patients with neuroendocrine tumours of the pancreas and gut. Endocr Relat Cancer 2003, 10: 459–62.
2. Ardill JES, O’Dorisio TM. Circulating biomarkers in neuroendocrine tumors of the enteropancreatic tract: application to diagnosis, monitoring disease, and as prognostic indicators. Endocrinol Metab Clin North Am 2010, 40: 777-90.

Marco Caputo
Dipartimento Servizi di Diagnosi e Cura, AUSL 22 Regione Veneto, Bussolengo (VR)

Nel complesso questi marcatori hanno uso clinico limitato.

L’enolasi neurone-specifica (NSE) è un enzima presente nelle cellule di derivazione neuroectodermica. La sua presenza è stata riportata in carcinomi tiroidei e prostatici, neuroblastomi, microcitomi polmonari e feocromocitomi. L’utilità clinica di questo marcatore è scarsa, vista la bassa specificità (1). Si trovano livelli elevati di NSE nel 30-50% dei pazienti con NET, in particolare in quelli scarsamente differenziati. La sensibilità nella diagnostica dei NET può essere aumentata dalla combinazione di NSE con CgA (2).

Il polipeptide pancreatico (PP) è secreto da cellule insulari specializzate; inibisce la motilità intestinale e la secrezione pancreatica esocrina. Il dosaggio di PP è stato proposto nella diagnosi e monitoraggio dei NET pancreatici non funzionanti: in combinazione con CgA ha sensibilità fino al 93% (3). I livelli di PP possono aumentare nell’anziano, e in seguito a diarrea, abuso di lassativi, processi infiammatori intestinali e nefropatie croniche.

La subunità beta della gonadotropina corionica (ßhCG), glicoproteina sintetizzata dal sinciziotrofoblasto in gravidanza, può essere aumentata nei pazienti con NET pancreatico (4), ma è priva di utilità per questo uso clinico.

Bibliografia

1. Seregni E, Ferrari L, Stivanello M, Dogliotti L. Laboratory tests for neuroendocrine tumours. Q J Nucl Med 2000, 44: 22-41.
2. Korse CM, Taal BG, Vincent A, et al. Choice of tumour markers in patients with neuroendocrine tumours is dependent on the histological grade. A marker study of chromogranin A, neuron specific enolase, progastrin-releasing peptide and cytokeratin fragments. Eur J Cancer 2012, 48 (5): 662–71.
3. Panzuto F, Severi C, Cannizzaro R, et al. Utility of combined use of plasma levels of chromogranin A and pancreatic polypeptide in the diagnosis of gastrointestinal and pancreatic endocrine tumors. J Endocrinol Invest 2004, 27: 6-11.
4. Shah T, Srirajaskanthan R, Bhogal M, et al. Alpha-fetoprotein and human chorionic gonadotrophin-beta as prognostic markers in neuroendocrine tumour patients. Br J Cancer 2008, 99: 72-7.